Dynabeads Tech Tip


 

1. Protein A/G beads 및 IP, Co-IP

 

2. Streptavidin beads


 

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Protein A/G beads 및 IP, Co-IP


Q. Antibody의 결합력이 약한 것 같습니다. 어떻게 하면 결합력을 강화시킬 수 있나요?

 

A. 먼저 ELISA와 같은 방법을 통해서 antibody의 binding/specificity를 확인하세요. 그런 다음 antibody와 beads가 binding하는지를 확인하세요. 만약 antibody와 beads가 binding하지 않으면 IP실험을 진행할 수 없습니다. 그리고 beads의 양과 sample volume을 확인하세요. 해당 제품의 insert에서 capacity를 확인할 수 있습니다. 이 때 beads의 양이나 antibody의 농도를 늘려보는 것도 한 방법입니다. 또한 incubation 시간을 늘리거나, 다른 antibody를 사용해보세요.

 

 

Q. Dynabeads protein G 또는 A가 BSA로 pre-blocking 되어있습니까?

 

A. 아니요. Pre-blocking 되어있지 않습니다.

 

 

Q. Dynabeads protein G 또는 A BSA blocking 하고 싶어요.

 

A. BSA hydrophobic 성질을 가지고 있고 Dynabeads protein A/G hydrophilic 성질을 지니고 있습니다. 때문에 BSA pre-blocking 필요가 없습니다. 다만, non-specific binding 줄이기 위해서 washing buffer Tween-20 detergent (0.01-0.1%) 첨가해서 사용하시기를 권장합니다.

 

 

Q. Negative control처럼 Dynabeads protein G에 아무런 antibody를 부착하지 않고 sample과 incubation 시켰습니다. 이 때 non-specific binding이 나왔습니다.

 

A. 아무런 antibody를 부착하지 않은 beads와 sample을 함께 incubation하는 것은 좋은 control의 예가 아닙니다. Sample내의 다른 물질들이 protein G나 beads에 binding할 수 있기 때문입니다. (hydrophobic interaction이나 charge interaction등을 통해서) 가장 좋은 negative control은 Dyanbeads protein G와 실험과 전혀 상관 없는 IgG를 binding시키는 것 입니다. 만약 정말로 낮은 level의 background binding을 원한다면, Dynabeads antibody coupling kit을 사용하세요. 이 kit에서 제공되는 beads는 굉장히 적은 background binding을 보입니다. 가지고 있는 antibody와 beads가 covalent coping되면, elution과정에서 beads와 antibody가 떨어지지 않을 것입니다.

 

 


Streptavidin beads


Q. IP를 수행하기 위해서 Biotinylated antibody와 streptavidin beads를 binding시켰습니다. 어떻게 antibody의 elution없이 target protein을 elution하나요?

 

A. High salt (>1M salt) 또는 low pH(0.1M glycine-HCL, pH2.5-3.0)의 buffer등과 같은 mild elution condition을 만듭니다. 또는 beads를 SDS buffer에 넣은 채로 heat inactivation (95℃, 5min)을 하지 마세요

 

 

Q. Biotinylated molecule의 immobilizing에는 어떤 buffer를 사용하는 게 좋은가요?

 

A. Biotinylated protein이나 다른 molecule은 PBS를, biotinylated nucleic acid는 B&W buffer를 추천해드립니다

*B&W buffer: 10.0 mM Tris-HCL (pH7.5), 1.0 mM EDTA, 2.0 M NaCl

 

 

Q. Streptavidin beads를 직접적으로 PCR에 이용할 수 있나요?

 

A. 네, beads가 enzyme reaction에 영향을 주지 않기 때문에 가능합니다. M-270, MyOne C1, MyOne T1은 전혀 영향을 미치지 않습니다. 다만 M-280 Streptavidin beads의 경우에는 전체 50 ul PCR reaction 중 75-100ug일 때, 그리고 농도가 100 ug/50 ul reaction을 넘을 때 PCR에 영향을 주는 것을 확인했습니다.

 

 

Q. Beads로 biotinylated dsDNA를 분리했는데요, biotin 없이 dsDNA만 분리할 수 있나요?

 

A. Biotin을 제거하는 방법은 두 가지가 있습니다.

 

1) Using heat:

 

1. DNA와 binding한 Dynabeads 50ul를 1x SSC buffer로 washing

2. Beads를 또 다른 1x SSC buffer 50 μl로 resuspension

3. 95 °C에서 5분 동안 incubation.

4. Magnet에 1-2분 동안 방치한 후 상층액을 새로운 tube에 옮김. 상층액에 non-biotinylated DNA가 포함되어 있습니다.

 

2) Using NaOH:

 

1. DNA와 binding한 Dynabeads 50ul를 1x SSC buffer로 washing

2. Beads를 0.15M NaOH 20ul에 resuspension.

3. RT에서 10분 간 incubation

4. Magnet에 1-2분 동안 방치한 후 상층액을 새로운 tube에 옮김. 상층액에 non-biotinylated DNA가 포함되어 있습니다.

5. 2.2ul 10x TE(pH 7.5), 1.3ul 1.25M acetic acid를 상층액에 넣어서 neutralization. DNA와 binding한 Dynabeads를 한 번은 50ul 0.1M NaOH로, 또 한 번은 50ul B&W buffer로, 마지막으로 50ul TE buffer로 washing.

*1 x SSC (0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate. Dissolve the reagents in 800 ml water. Adjust pH to 7.0 with NaOH. Adjust the volume to 1 liter with water).

 

 

Q. Streptavidin-coupled Dynabeads와 biotinylated molecule을 어떻게 분리하나요?

 

A. Streptavidin-biotin 사이의 결합력은 굉장히 강하다고 알려져 있습니다. 때문에 강력한 방법을 통해서만 분리할 수 있는데요. 자세한 Elution guide는 아래를 참고해주세요.

 

1) Biotinylated nucleic acids

: 95% formamide+10mM EDTA, pH 8.2 용액에 65℃ 5분, 또는 90℃에서 2분간 incubation.

Beads를 magnet에 고정시킨 후 상층액만 다른 tube에 옮김. 상층액에 biotinylated nucleic acid가 들어있음.

 

2) Biotinylated proteins

: 0.1% SDS 또는 SDS-PHAGE buffer를 넣고 3분간 끓임

 

 

Q. M-280 Streptavidin beads를 이용해서 DNA binding protein을 잡은 후 oligo를 sample에 넣었습니다. (Indirect methods). Oligo와 beads의 binding을 위해서 B&W buffer를 사용하라고 되어 있는 데요, B&W buffer가 DNA-protein interaction에 영향을 주지는 않나요?

 

A. B&W buffer는 protein이 없을 때 oligo를 beads에 고정시키는 direct methods에서 사용되는 buffer입니다. Indirect methods에서는 150mM 이하의 salt농도를 가지는 buffer를 이용하시기를 권장합니다.


학술 마케팅팀: 한소영  techserv@woongbee.com

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