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Neo-STEM/ Neo-Live Technical Tip

세포당 얼마만큼의 나노 입자가 들어 가나요?

세포 종류에 따른 incubation 시간은 어떻게 되나요?

세포 배지 내에 FBS 가 들어 있어도 염색에는 영향을 주지 않나요?

Plate 표면 등에는 나노 입자가 부착되지 않나요?

다른 staining dye 와 함께 사용 가능한가요?

Labeling 후 washing 과정은 필수적인가요?

일반적인 형광현미경에서 관찰 가능한가요?

제품 dilution을 PBS 에 해도 되나요?

Amine 기와 Carboxyl 기는 얼마나 붙어 있나요?

Amine 기와 Carboxyl 기를 붙일 때는 그냥 붙일 수 있나요?

Labeling 하려는 세포의 크기가 작으면 어떤 크기의 나노 입자를 사용해야 하나요?

세포분열에 따른 나노 입자의 division 현상이 예상되는데 어떠한가요?

Photostable 한 이유가 뭔가요?

어떤 세포가 labeling 이 잘 되지 않나요?

H&E 염색하였는데, 형광이 보이지 않아요?

In vivo 에서 세포가 분화, 분열되어도 labeling이 유지되나요?

In vivo 에서 얼마나 오랫동안 관찰 가능할까요?

세포분열에 따른 NEO-STEM의 division 현상이 예상되는데, in vivo 에서 얼마나 detection가능 할까요?

조직의 autofluorescence 와 나노입자 labeling 된 세포의 구분은 어떻게 하나요?

나노입자를 경구로 먹이면 어디로 가나요?

보통의 chemical 들은 tail vein에 주입하면 urine 으로 많이 나가는데 나노입자는 어떻게 되나요?

In vivo injection 된 세포가 죽으면, 세포 내 있던 나노입자가 주변에 다른 세포에 염색되지는 않나요?

In vivo 에서 죽은 세포에서 나온 나노입자는 in vivo밖으로 나오는지? 아니면 계속 혈액 안에서 돌아 다니는 것인지?

그렇다면 과연 독성은 없나요?

In Vivo Live Image 관찰 시 auto fluorescence 제거 방법은 뭔가요?

In Vitro

Q : 세포당 얼마만큼의 나노입자가 들어 가나요?

A : 약 6 X 10⁶ 개만큼 들어갑니다.

Q : 세포 종류에 따른 incubation 시간은 어떻게 되나요?

A : Endocytosis 기능이 활발히 일어나는 세포에서는 2시간에도 충분하지만 그렇지 않은 경우 24시간까지 incubation 시간을 늘리시면 됩니다. (예 - cancer cell 2 ~ 4시간, MSC 12 ~ 24시간, primary cell (24 시간) 

Q : 세포 배지내에 FBS 가 들어 있어도 염색에는 영향을 주지 않나요?

A : Serum 이 있어도 cell labeling 에는 영향을 주지 않습니다. 세포배양 조건에 맞는 cell growth media 를 사용하십시오.

Q : Plate 표면 등에는 나노입자가 부착되지 않나요?

A : Labeling 되지 않고 남은 나노입자가 plate 에 가라앉는 경우가 생길 수 있습니다. 이는 washing시 제거되지만, Plate 표면 coating등에 따라 washing시 제거 되지 않는 경우도 있습니다. 이런 경우에는 세포를 새 plate에 다시 seeding 하시면 좋은 Image 를 얻을 수 있습니다.

Q : 다른 staining dye 와 함께 사용 가능한가요?

A : Em 파장대가 겹치지 않을 경우 사용 가능합니다. 현미경 filter의 종류(narrow, long pass filter 등)에 따라 차이가 있습니다.

Q : Labeling 후 washing 과정은 필수적인가요?

A : Washing 을 하지 않을 경우 배지에 남은 나노 입자로 인해 labeling 된 세포를 구분하시기 어렵습니다. 반드시 washing 과정이 필요합니다.

Q : 일반적인 형광현미경에서 관찰 가능한가요?

A : 보유하고 계신 형광현미경의 FITC, RITC등 원하시는 형광 파장의 filter 가 장착 되어 있다면 가능합니다. 다만, Neo-LIVE 제품은 장파장의 제품으로 Maestro, Nuance등 특수장비가 필요합니다. 또한, 형광 현미경의 filter가 narrow band일 경우 dual staining 도 가능합니다.

Q : 제품 dilution을 PBS 에 해도 되나요?

A : Labeling 시간이 길기 때문에 세포 손상이 우려되므로 PBS dilution은 권장하지 않습니다.

Q : Amine 기와 Carboxyl 기는 얼마나 붙어 있나요?

A : 일반적으로 2 ㎎/㎖ 에 10¹⁴-10¹⁵ 개 정도 있습니다.

Q : Amine 기와 Carboxyl 기를 붙일 때는 그냥 붙일 수 있나요?

A : Amine 은 나노 입자표면의 –OH 기에 한번에 처리하고, Carboxyl 은 두 단계로 처리하는데 먼저 amine 으로 만든 다음 succinic anhydride를 처리하여 carboxyl 기를 도입합니다.

Q : Labeling 하려는 세포의 크기가 작으면 어떤 크기의 나노입자를 사용해야 하나요?

A : 50 ㎚ 크기의 나노 입자를 사용 하셔도 무방합니다. 세포크기는 마이크로 사이즈이기 때문에 labeling 에는 문제가 없으며, 세포의 endocytosis 정도가 더 중요한 factor 입니다.

Q : 세포분열에 따른 나노입자의 division 현상이 예상되는데 어떠한가요?

A : 세포 분열 시 나노입자의 division 현상이 관찰됩니다. 권장 농도 0.2 ㎎/㎖ 로 labeling 된 MSCs 가 In vitro 에서 8-9 passage 까지 관찰 됩니다.또한, 세포의 labeling incubation time 및 uptake 정도에 따라 지속가능 passage 는 변동 가능합니다.

Q : Photostable 한 이유가 뭔가요?

A : Caging effect라 불리는 효과 때문으로 형광 염료를 쌓고 있는 SiO₂가 형광 염료의 화학적 구조를 고정시켜 형광 염료를 안정화 시키기 때문입니다. (Reference : Small 2006 Vol. 2 pp.209-215, Langmuir 1999 Vol. 15, pp6170-6180

Q : 어떤 세포가 labeling 이 잘 되지 않나요?

A : Enocytosis 기능을 이용하여 나노입자가 세포 내 uptake 가 되기 때문에 endocytosis 기능이 저하된 세포에서는 labeling 이 잘 되지 않을 수 있습니다.

Q : H&E 염색하였는데, 형광이 보이지 않아요

A : H&E 시약 자체가 형광을 가지고 있기 때문에 H&E와는 동시에 불가능 합니다.

In Vivo

Q : In vivo 에서 세포가 분화, 분열되어도 labeling이 유지되나요?

A : 세포분열이 되면 딸 세포로 나노입자를 나누어 갖기 때문에 처음보다 Fluorescent intensity가 낮아집니다. 하지만 세포분화 시 세포질내의 Particle 수는 유지되기 때문에 형광의 감소는 없습니다.

Q : In vivo 에서 얼마나 오랫동안 관찰 가능할까요?

A : 저희 나노입자를 사용하여 labeling 된 Human MSC, 1 X 10⁶ cell 을 mouse liver에 portal vein 으로 injection 하였을 때 6개월까지 관찰한 논문이 있습니다. (Nanomedicine. 2009 Aug 20. Epub ahead of print)

Q : 세포분열에 따른 NEO-STEM의 division 현상이 예상되는데, in vivo 에서 얼마나 detection 가능 할까요?

A : 저희 나노입자를 사용하여 labeling 된 Human MSC, 1 X 10⁶ cell 을 mouse liver에 portal vein 으로 injection 하였을 때 6개월까지 관찰한 논문이 있습니다. (Reference Nanomedicine. 2009 Aug 20. Epub ahead of print)

Q : 조직의 autofluorescence 와 나노입자 labeling 된 세포의 구분은 어떻게 하나요?

A : In vivo 실험 시 negative control(normal mouse )과 같이 관찰하는 것을 권장합니다. Maestro^TM 의 경우 형광파장 분석을 통하여 autofluorescense 와 구분이 가능하나 기타 장비의 경우 negative control 과 비교 하시는 것이 가장 정확합니다.

Q : 나노입자를 경구로 먹이면 어디로 가나요?

A : 경구 투여의 경우 실험한 결과가 없습니다.

Q : 보통의 chemical 들은 tail vein에 주입하면 urine 으로 많이 나가는데 나노입자는 어떻게 되나요?

A : Clearance time 이나 배출 양을 확인한 실험이 진행되진 않았지만 In vivo injection 실험 시 간 및 신장에서 다수 관찰됩니다. 이에 신장을 통해 다수 배설될 것으로 예상하고 있습니다.

Q : In vivo injection 된 세포가 죽으면, 세포 내 있던 나노입자가 주변에 다른 세포에 염색되지는 않나요?

A : 세포 괴사 및 사멸 시 배출되는 나노입자는 혈액 및 림프액의 흐름에 따라 체내로 분산되어 배설됩니다. 일부 주변 세포로 uptake 가 가능하나 이 경우 labeling 된 세포와 형광세기가 현격히 차이 나기 때문에 형광현미경 관찰 시 구분 가능합니다.

Q : In vivo 에서 죽은 세포에서 나온 나노입자는 in vivo 밖으로 나오는지? 아니면 계속 혈액 안에서 돌아 다니는 것인지? 그렇다면 과연 독성은 없는지?

A : 죽은 세포에서 나오는 소량의 나노입자는 일부는 주변 세포로 uptake 되며 일부는 면역관련 세포에 탐식되며 일부는 혈액 등으로 순환되다 배설됩니다. In vitro 및 in vivo 실험 시 독성이 없음을 확인하였습니다.  (Reference: Toxicological science 2006 Vol. 89, pp.338-347)

Q : In vivo Live image 관찰 시 auto fluorescence 제거 방법은 뭔가요?

A : In vivo image 를 얻기 위해서는 단파장일수록 auto fluorescence 가 증가되기 때문에 장파장 계열(NIR)을 사용하시는 것을 권장합니다. 그 외 auto fluorescence 제거 방법으로 free 사료 (Alfalfa free 사료)를 먹이시면 간섭현상을 줄일 수 있습니다. 또한 혈액을 제거하거나, narrow pass filter를 사용하실 것을 권해 드립니다. 또한 상처 부위나 염증 부위에 auto fluorescence가 강하게 나올 수 있기 때문에 정확한 signal이 맞는 지 확인 하셔야 합니다.

학술 마케팅팀: 최미선  techserv@woongbee.com